HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中關(guān)鍵部件為輸液泵、 色譜柱、檢測器。有些液相色譜儀器儀器還配備有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。
常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司(例如 安捷倫液相色譜儀Agilent 1200分析速度可以比標(biāo)準(zhǔn)液相 快20倍，同時分離度提高60%。它的分析速度比同類廠家的快速液相快1至2倍。 1200高分離度快速液相還可以運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)液相色分析方法，是市場上zui靈活的液 相色譜系統(tǒng)。若配備高通量進(jìn)樣系統(tǒng)，1200高分離度快速液相色譜甚至每天可 以分析多達(dá)2000個樣品。如圖1 )、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。
*：輸掖泵的選擇
輸液泵是HPLC系統(tǒng)中zui重要的部件之一，目前應(yīng)用zui多的是柱塞往復(fù)泵，柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫，其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好(RSD為 0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%)，但出故障的機(jī)會較多(因多一單向閥)，價格也較貴。泵的性能好壞將直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可*性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其 RSD應(yīng)<0.5%，這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要;②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10 ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100 ml/min;③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300 kg/cm2;④液缸容積小;⑤密封性能好，耐腐蝕。
第二：進(jìn)樣器的選擇
進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動進(jìn)樣。
1.隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得* 的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用(如10MPa以上);此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1~2%;加之能耐各 種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。
2.停流進(jìn)樣。可避免在高壓下進(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)“鬼峰”;另一缺點(diǎn)是保留時間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3.閥進(jìn)樣。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥(以美國Rheodyne公司的7725和7725i型zui常見)，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子) 和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣(約下降5~10%左右)，但耐高壓(35~40MPa)，進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重 復(fù)性好(0.5%)，操作方便。
4.自動進(jìn)樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。
第三：色譜柱的選擇
色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用 于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等，其粒度一般為 3,5,7,10μm等，柱效理論值可達(dá)5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效;對于同系物分析，只要500即可;對于較難分離物質(zhì)對 則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。
柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到*效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù)。即使zui 好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，*近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是 管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。
1.柱的構(gòu)造
色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi) 壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑 0.2~20μm(5~10μm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱(常量柱)，內(nèi)徑2~5mm(常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm)， 柱長10~30cm;②窄徑柱(narrow bore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn)，內(nèi)徑1~2mm，柱長10~20cm;③毛細(xì)管柱(又稱微柱 microcolumn)，內(nèi)徑0.2~0.5mm;④半制備柱，內(nèi)徑>5mm;⑤實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm;⑥生產(chǎn) 制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。
2.柱的發(fā)展方向
因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3μm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑 小于0.2mm的微徑柱(microbore)。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動相;②靈敏度增加;③樣品量少;④能使用長柱達(dá)到高分離度;⑤容易控制柱 溫;⑥易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。
但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測)，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè) 備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100μl/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電 化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。
3.柱的填充和性能評價
色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度>20μm時，干法填充制備柱較為合適;顆 粒<20μm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充;②徑向加壓法，Waters;③軸 向加壓法，主要用于裝填大直徑柱;④干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。
必須指出，液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下(樣 品、流動相、流速、溫度)下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性 在±5%或±10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。
一份合格的色譜柱評價報告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。
第四：檢測器的選擇
檢測器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴?/span>HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低(即對溫度、流量等外界變化不敏感)、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。
1.性能指標(biāo)
1)噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度 和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速(泵的脈動)和溶劑(純度、含有氣泡、固定相流失)的影響。噪音和漂移都會影響測 定的準(zhǔn)確度，應(yīng)盡量減小。
2)靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電 信號的大小，單位為mV·ml/g。對質(zhì)量型檢測器，它表示在單位時間內(nèi)通過檢測器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mV·s/g。
2)檢測限(detection limit)
檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測zui小樣品量或zui低樣品濃度能力的高低，因?yàn)樵诙x靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關(guān)的。
檢測限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(通常用2倍或3倍噪音表示)時進(jìn)入檢測器的某組分的量(對濃度型檢測器指在流動相中的濃度——注意與分析方法檢 測限的區(qū)別，單位g/ml或mg/ml;對質(zhì)量型檢測器指的是單位時間內(nèi)進(jìn)入檢測器的量，單位g/s或mg/s)。又稱為敏感度(detectability)。D=2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。
檢測限是檢測器的一個主要性能指標(biāo)，其數(shù)值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關(guān)外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān)。
3)線性范圍(linear range)：指檢測器的響應(yīng)信號與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下，zui大與zui小進(jìn)樣量(濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度)之比。也可用響 應(yīng)信號的zui大與zui小的范圍表示，例如Waters 996 PDA檢測器的線性范圍是-0.1~2.0A。
定量分析的準(zhǔn)確與否，關(guān)鍵在于檢測器所產(chǎn)生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。輸出信號與樣品量呈線性關(guān)系，這樣進(jìn)行定量測定 時既準(zhǔn)確又方便。但實(shí)際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。通常A=BCx，B為響應(yīng)因子，當(dāng)x=1時，為線性響應(yīng)。對大多數(shù)檢測器來說，x只在 一定范圍內(nèi)才接近于1，實(shí)際上通常只要x=0.98~1.02就認(rèn)為它是呈線性的。
線性范圍一般可通過實(shí)驗(yàn)確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。
4)池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10μl。在使用細(xì)管徑柱時，池體積應(yīng)減少到1~2μl甚至更低，不然檢測系統(tǒng)帶來的峰擴(kuò)張問題就會很嚴(yán)重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計(jì)，否則會嚴(yán)重影響柱效和靈敏度。
第五：數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)
計(jì)算機(jī)的用途包括三個方面：①采集、處理和分析數(shù) 據(jù);②控制儀器;③色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專家系統(tǒng)。
第六：恒溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。
溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質(zhì)在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K，但對分離選擇性影響不大;還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產(chǎn)生氣泡。
色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結(jié)構(gòu)的變化，對分離有影響;但如使用硬質(zhì)填料則影響不大。
總的說來，在液固吸附色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著，通常實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行操作。在液固色譜中有時將極性物質(zhì)(如緩沖劑)加入流動相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時溫度對保留值的影響很大。
不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和zui小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內(nèi)。
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