1 實(shí)驗(yàn)部分
1． 1 儀器與試劑
Agilent 1220 液相色譜儀，配自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent G1315B 二極管陣列檢測(cè)器( 美國(guó)Agilent公司) ; RE-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器; KQ-5200 型超聲波清洗儀; TGL-16M 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī); Milli-Q 去離子水發(fā)生器( 美國(guó)Milli-Q 公司) 。乙腈( 色譜純) ; 甲酸、乙酸銨、三乙胺、冰醋酸( 分析純) ; C12-BAC、C14-BAC、C16-BAC( 純度≥99%，美國(guó)Sigma 公司) 。樣品: 本單位檢驗(yàn)樣品。
1． 2 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液、工作溶液及緩沖溶液的配制
分別準(zhǔn)確稱(chēng)取C12-BAC、C14-BAC、C16-BAC 標(biāo)準(zhǔn)品各0. 1 g，至0. 000 1 g，用20%甲醇水溶液配成10 g /L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，該溶液在4 ℃下保存。取適量的上述3 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用含0. 5% 甲酸的甲醇配成分別為5. 0、25、100. 0、500. 0、1 000. 0、3 000. 0 mg /L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。乙酸銨緩沖溶液: 稱(chēng)取3. 08 g 乙酸銨置于燒杯中，加水溶解并定容至1 000 mL，加1 mL 三乙胺，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 至4. 0，過(guò)0. 45 μm 濾膜，待用。
1． 3 樣品處理方法
1． 3． 1 護(hù)發(fā)素等膏霜類(lèi)樣品
稱(chēng)取0. 5 g 樣品，至0. 01 g，置于25 mL 比色管中，加入20 mL 含0. 5% 甲酸的甲醇超聲波提取20 min，然后加入0．2 g 氯化鈉，用含0. 5% 甲酸的甲醇定容至刻度，經(jīng)濾紙過(guò)濾，吸取15 mL 濾液至100 mL 蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，并將其接至旋轉(zhuǎn)器上，于45℃水浴中減壓蒸餾至干，然后準(zhǔn)確用3 mL 含0. 5%甲酸的甲醇溶解，經(jīng)濾紙過(guò)濾，過(guò)0. 45 μm 濾膜，濾液供HPLC 分析。
1． 3． 2 洗發(fā)水等液態(tài)樣品
稱(chēng)取1. 0 g 樣品，至0. 01 g，置于10 mL 容量瓶中，加入9 mL 含0. 5% 甲酸的甲醇，超聲波提取10 min，用含0. 5%甲酸的甲醇定容至刻度，經(jīng)濾紙過(guò)濾，過(guò)0. 45 μm 濾膜，濾液供HPLC 分析。
1． 4 HPLC 條件
色譜柱: 資生堂CAPCELL PAK SCX 柱( 250mm × 4. 6 mm，5 μm) ; 柱溫: 30 ℃; 進(jìn)樣量: 20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng): 260 nm; 流動(dòng)相: ( A) 乙腈和( B) 乙酸銨緩沖溶液( pH 4. 0) ; 梯度洗脫程序: 0 ～ 15 min，100%A 線性降至75% A; 15 ～ 20 min，75% A; 20～ 26 min，100%A。流速: 1. 0 mL /min。
1． 5 定性定量方法
采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間和峰掃描光譜純度對(duì)照兩種方式對(duì)樣品峰進(jìn)行定性，以外標(biāo)法定量。2 結(jié)果與討論
2． 1 樣品提取
為了充分提取樣品中的苯扎氯銨，本實(shí)驗(yàn)先分別選擇乙腈、甲醇、正己烷作為樣品提取溶液進(jìn)行提取，但試驗(yàn)結(jié)果均不理想( 加標(biāo)回收率低于50%) ?？紤]到苯扎氯銨為弱堿性化合物，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)含0. 5% 甲酸的甲醇能有效地提取樣品中苯扎氯銨( 平均加標(biāo)回收率高于90%) ，因此選擇此溶液作為樣品提取液。此外，為了提高方法的檢出限，本實(shí)驗(yàn)選擇將護(hù)發(fā)素等膏霜類(lèi)樣品提取溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)富集后再進(jìn)行色譜分析。
2． 2 HPLC 條件的優(yōu)化
2． 2． 1 色譜柱的選擇
考慮到苯扎氯銨為季銨鹽類(lèi)陽(yáng)離子，而且化妝品中基質(zhì)干擾較大，為了簡(jiǎn)化樣品的前處理凈化步驟，本實(shí)驗(yàn)選擇SCX 陽(yáng)離子色譜柱作為本方法的色譜分析柱。
2． 2． 2 流動(dòng)相的選擇
苯扎氯銨為弱堿性化合物，而且3 種苯扎氯銨同系物的性質(zhì)極為相近，為了有利于色譜峰的分離及峰形的改善，本方法采用乙酸銨緩沖溶液( pH4. 0) 和乙腈為流動(dòng)相，利用梯度洗脫的方法提高分離效果，測(cè)試開(kāi)始時(shí)，流動(dòng)相中乙酸銨緩沖溶液( pH4. 0) 與乙腈的比例為0∶ 100，然后在0 ～ 15 min 內(nèi)將二者的比例調(diào)整為25∶ 75，通過(guò)上述梯度，可以較好地分離3 種苯扎氯銨同系物。
2． 2． 3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
對(duì)苯扎氯銨標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用紫外光譜儀進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)其在215 nm 和260 nm 附近處有共同較大吸收峰，215 nm處響應(yīng)值比260 nm 響應(yīng)值高10 倍左右，但是215 nm 為紫外區(qū)域的極限，大多數(shù)化合物在此有強(qiáng)吸收，因此從色譜測(cè)定角度考慮，本方法選擇260 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。在上述優(yōu)化的色譜條件下得到了令人滿意的結(jié)果( 見(jiàn)圖1) 。
2． 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限
將逐級(jí)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作液( 5. 0、25. 0、100. 0、500. 0、1 000. 0、3 000. 0 mg /L) 分別進(jìn)樣20 μL，以分析物的質(zhì)量濃度x ( mg /L) 為橫坐標(biāo)，峰面積y 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，在5. 0 ～ 3 000. 0 mg /L 范圍內(nèi)得到的線性關(guān)系: C12-BAC，y = 0. 847x － 1. 635( r = 0. 999 9) ; C14-BAC，y = 0. 580x － 0. 569 ( r =0. 999 9) ; C16-BAC， y = 1. 218x + 0. 568 ( r =0. 999 9) 。同時(shí)進(jìn)行樣品添加試驗(yàn)，以信噪比( S /N) 為3 確定3 種苯扎氯銨同系物的檢出限，用空白樣品提取液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在信噪比均大于3 的條件下，將此添加量定為檢出限。在空白樣品( 護(hù)發(fā)素) 中添加200 mg /kg 的3 種苯扎氯銨同系物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1. 3. 1 節(jié)方法處理后，經(jīng)測(cè)定6 個(gè)平行樣品中3 種苯扎氯銨同系物的S /N 均大于10，平均回收率大于92%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差( RSD) 低于7%，因此將200 mg /kg 定為方法的定量限。
2． 4 回收率和精密度
每組準(zhǔn)確稱(chēng)取空白護(hù)發(fā)素類(lèi)樣品6 份，每份0. 50 g，共3 組，分別定量加入C12-BAC、C14-BAC、C16-BAC 標(biāo)準(zhǔn)品，添加水平分別為200、400、1 000mg /kg，按1. 3. 1 節(jié)方法制備后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1 中可看出，不同濃度的平均加標(biāo)回收率為92. 5%～ 102. 1%，平均RSD 為3. 81%～ 6. 66%( n =6) ，滿足實(shí)驗(yàn)要求。
利用本方法對(duì)市場(chǎng)銷(xiāo)售的25 種各類(lèi)化妝品進(jìn)行檢測(cè)，其中2 種品牌的洗發(fā)水檢出C14-BAC，含量分別為317. 74 mg /kg 和222. 18 mg /kg，其他各類(lèi)化妝品未檢出目標(biāo)化合物。圖2 為其中一種陽(yáng)性樣品的色譜圖。
結(jié)語(yǔ)
建立了化妝品中3 種苯扎氯銨同系物同時(shí)測(cè)定的HPLC 方法。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇和優(yōu)化，確定了色譜條件，在20 min內(nèi)3 種苯扎氯銨同系物可達(dá)到*基線分離，而且能有效地排除基質(zhì)中其他物質(zhì)的干擾。方法的線性關(guān)系、回收率及精密度等各項(xiàng)參數(shù)表明，方法的靈敏度和準(zhǔn)確度均滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要。該方法的樣品前處理簡(jiǎn)單易行，分析快速，對(duì)化妝品中3 種苯扎氯銨同系物能有效的提取、分離和測(cè)定，結(jié)果良好。
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