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1 材料與方法

1． 1 主要儀器

液相色譜儀HPLC( 配有四元梯度泵、紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器) ，超聲波振蕩器，固相萃取裝置，離心機(jī)，氮吹儀，振蕩器。

1． 2 試劑

甲醇( MERCK 色譜純) ，羅丹明B( AR，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所) ，正己烷( AR)

1． 3 色譜條件

Acclaim 120 C18柱( 5 μm，4． 6 mm × 250 mm) ; 進(jìn)樣量:20 μl; 流動(dòng)相: 甲醇+ 水( 75 + 25) ，流速1． 0 ml /min;檢測(cè)波長(zhǎng): 550 nm。

1． 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)物( 羅丹明B) 用75% 甲醇配制成1 mg /ml，再用75% 甲醇稀釋成0． 1 μg /ml，0． 5 μg /ml，1． 0 μg /ml，5． 0μg /ml， 10． 0 μg /ml 標(biāo)準(zhǔn)系列。

1． 5 樣品前處理

1． 5． 1 提取

1． 5． 1． 1 辣椒粉，調(diào)味品，水制辣椒醬: 5 g 樣品，加5 ml 甲醇，振蕩器振蕩2 min，超聲10 min， 4000 r /min 離心10 min，取上清液備用。

1． 5． 1． 2 油制辣椒醬，肉類(lèi): 5 g 樣品，加5 ml 甲醇，振蕩器振蕩2 min，超聲10 min，加正己烷5 ml，振蕩器振蕩2 min，4000 r /min離心10 min，取醇層備用。

1． 5． 2 凈化

Sep － pak C18小柱用3 ml 甲醇活化，5ml 水平衡，吸提取液2． 5 ml 加2． 5 ml 水注入固相萃取小柱，控制流速5 ml /min ～ 8 ml /min，依次用5 ml 水、5 ml 50% 甲醇淋洗。再用75%甲醇洗脫，收集洗脫液。

1． 5． 3 濃縮

洗脫液置50℃ 水浴，氮吹儀吹干，用1． 0 ml75%甲醇溶解殘?jiān)?，過(guò)0． 45 μm 濾膜，供液相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2． 1 波長(zhǎng)選擇

羅丹明B 的75%甲醇溶液于紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描，測(cè)得該溶液在550 nm 有zui大吸收，選擇550 nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)，既可以保證有zui高靈敏度，也可以排除許多無(wú)顏色有機(jī)物的干擾。

2． 2 流動(dòng)相選擇

選擇液相色譜zui為普通的甲醇、水作為流動(dòng)相，既避免了接觸毒性較大乙腈，又減少其它溶液配制步驟，但流動(dòng)相中甲醇比例太低時(shí)，羅丹明B 很難洗脫出來(lái)，100% 甲醇又比較快就洗脫出來(lái)，選擇75%甲醇作為該方法的流動(dòng)性，既可以保證羅丹明B 在適當(dāng)時(shí)間( 保留時(shí)間8． 6 min) 內(nèi)洗脫出來(lái)，又可以與大部分干擾物質(zhì)分離。

2． 3 方法線性范圍與檢出限

標(biāo)準(zhǔn)系列各進(jìn)樣20 μl，得到其色譜圖( 見(jiàn)圖3) ，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線; 其線性回歸方程為Y = 0． 3282 + 5． 2339X，相關(guān)系數(shù)為0． 9994。該方法在0． 1 μg /ml ～ 10 μg /ml 的線性良好，檢出限0． 02 μg /ml，定量下限0． 05 μg /ml。樣品進(jìn)樣20 μl，得到其色譜圖( 見(jiàn)圖1，2) ，其峰面積在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其對(duì)應(yīng)的含量，或者將其峰面積代入線性回歸方程得到其對(duì)應(yīng)的含量。按上述步驟操作，樣品檢測(cè)限低至0． 008 mg /kg。

2． 4 方法回收率與精密度

在樣品中加入高、中、低三個(gè)不同量的標(biāo)準(zhǔn)，使每一濃度分別進(jìn)行6 次重復(fù)測(cè)定，回收率，精密度見(jiàn)表1。

該方法回收率在96． 1% ～ 100． 4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD( %) 在1． 8% ～ 3． 9%，說(shuō)明方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

2． 5 方法干擾試驗(yàn)

圖1，圖2 分別是羅丹明B 陰性，陽(yáng)性樣品，由于選擇的波長(zhǎng)為550 nm，落在可見(jiàn)光區(qū)，食品中許多無(wú)顏色的有機(jī)物在該波長(zhǎng)下均未吸收或吸收很小，可以忽略不計(jì)，所以基線很平滑，干擾物質(zhì)很少; 圖3 是羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)物色譜圖; 圖4 是含有羅丹明B，胭脂紅，莧菜紅，誘惑紅，赤鮮紅，蘇丹紅Ⅰ，蘇丹紅Ⅱ，蘇丹紅Ⅲ，蘇丹紅Ⅳ各5 μg /ml 溶液的色譜圖，由圖3，圖4可以看出在該色譜條件下常見(jiàn)的水溶性紅色色素胭脂紅，莧菜紅，誘惑紅，赤鮮紅和常見(jiàn)的脂溶性紅色色素蘇丹紅Ⅰ，蘇丹紅Ⅱ，蘇丹紅Ⅲ，蘇丹紅Ⅳ均未對(duì)羅丹明B 檢測(cè)造成干擾。

3 結(jié)論

本方法*國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)空白，由于液相色譜－ 紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器比較普及，適合于基層單位羅丹明B 檢驗(yàn)，為打擊“食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)”提供有力依據(jù)。本方法操作簡(jiǎn)單，由于選擇波長(zhǎng)為550 nm，在可見(jiàn)光波段，干擾少，選擇性好，靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度都很好。