1 儀器與試藥
日立公司氨基酸自動(dòng)分析儀，型號(hào)為L(zhǎng) － 8800 : 17 種L － 氨基酸混合標(biāo)樣( 0. 1 mol·L － 1 HCl 儲(chǔ)備液) 由sigma 提供，不同pH 值和離子強(qiáng)度洗脫用緩沖溶液，茚三酮等( 按儀器說(shuō)明書(shū)配制) 。Bruker 傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜，型號(hào)為IV FT －MS。Elite 液相色譜儀: Elite UV230Ⅱ檢測(cè)器，Elite ZW Ⅱ柱溫箱，Elite ES2600 工作站。焦谷氨酸含量為98%，由Alfa aesar 提供。山羊角及山羊角提取物( 批號(hào): 091001) 乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。
2 山羊角提取物中焦谷氨酸的確認(rèn)
2. 1 氨基酸成分檢測(cè)
2. 1. 1 樣品的配置
山羊角水解液的制備：
取山羊角，制成粉末，精密稱取約0. 5 g，置于安瓿瓶中，加入濃硫酸10 mL，氮?dú)獗Ｗo(hù)后，封口于100 ℃恒溫酸水解12 h，取出水解液，用氫氧化na溶液調(diào)pH = 7，制成山羊角水解液。
山羊角提取物溶液的制備:
準(zhǔn)確稱取山羊角提取物約0. 5 g，溶入10 mL 水中，制成山羊角提取物溶液。取山羊角水解液及山羊角提取物溶液各1 mL，用0. 45 μm 濾膜過(guò)濾。并與氨基酸自動(dòng)分析儀所用鹽酸溶液等比例混合，供檢測(cè)。
2. 1. 2 氨基酸自動(dòng)分析
調(diào)整儀器參數(shù)及洗脫液pH，使各氨基酸分辨率≥85%，分別自動(dòng)進(jìn)樣制備好的山羊角水解液和山羊角提取物溶液各20 μL 進(jìn)行分析，其中緩沖溶液流速為0. 400 mL ·min － 1。茚三酮溶液為0. 350 mL ·min － 1。結(jié)果見(jiàn)圖1。
2. 2 傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜
2. 2. 1 質(zhì)譜條件
掃描方式為電噴霧負(fù)離子模式，掃描范圍: 0 ～ 300 m/z，干燥氣溫度: 200 ℃，干燥氣流量: 12 L ·min －1，霧化氣流量: 6 L ·min － 1，電噴霧電壓為2. 3 kV。注射泵進(jìn)樣速度2 μL ·min － 1。2. 2. 2 樣品處理取微量山羊角提取物，溶于甲醇中，加入適量乙酸，促進(jìn)其離子化。用0. 25 mL 注射器吸取一定體積樣品液固定在注射泵上，直接進(jìn)樣。2. 2. 3 質(zhì)譜結(jié)果見(jiàn)圖2。
2. 3 焦谷氨酸的確定
從氨基酸自動(dòng)分析儀上我們可以很清楚地看出，山羊角提取物與山羊角水解液的氨基酸有一定的差別，而谷氨酸含量zui多且差別較大( 見(jiàn)圖1) 。根據(jù)分析認(rèn)為1 種可能性是山羊角提取物中谷氨酰胺水解不*所導(dǎo)致，而谷氨酰胺在酸性環(huán)境下可轉(zhuǎn)化為谷氨酸; 而另1 種可能性是谷氨酸在山羊角處理過(guò)程中轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。但考慮到山羊角提取物為山羊角在過(guò)量硫酸中于106 ℃處理16h，水解較*，可以排除第1 種可能性; 而在山羊角提取物制取過(guò)程中有烘干步驟，且谷氨酸加熱后易脫水轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸( 圖3) 。為了驗(yàn)證上述的判斷，對(duì)山羊角提取物進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了m/z 128. 03548 離子峰，其匹配*分子式為C5H6NO3，因其是ESI －模式下，主要的離子化反應(yīng)是質(zhì)子轉(zhuǎn)換和電荷交換，因此可能形成M－。所以分子式應(yīng)為C5H7NO3，符合焦谷氨酸的分子式，而m/z 146. 04642離子峰，其分子式應(yīng)為C5H9NO4，確定其為谷氨酸，并且沒(méi)有谷氨酰胺的分子峰出現(xiàn)。此后的液相分析也佐證了的判斷，在相同時(shí)間，焦谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品與山羊角提取物供試品有同一時(shí)間峰。故可以肯定山羊角提取物中含有焦谷氨酸。
3 含量測(cè)定
3. 1 色譜條件
采用Sionchrom ODS － BP 色譜柱( 200 mm × 4. 6 mm，5 μm) ，以流速為1. 0 mL·min － 1，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm，柱溫27℃。流動(dòng)相: 乙腈－ 3. 5 mmol·L － 1 磷酸氫二鈉緩沖液( 1∶ 99) ，用磷酸調(diào)pH = 3，上樣20 μL。
3. 2 溶液的制備
3. 2. 1 對(duì)照品溶液
稱取焦谷氨酸對(duì)照品適量，用流動(dòng)相配成136 μg ·mL － 1的溶液。
3. 2. 2 供試品溶液
取山羊角提取物約1 g，精密稱定，置于1 L 量瓶中，用流動(dòng)相定容即可。
3. 3 線性關(guān)系考察
將對(duì)照品溶液等倍稀釋為136， 68， 34， 17， 8. 5 μg ·mL － 1，按上述液相條件分別進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品量為( X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值( Y) 為縱坐標(biāo)，得回歸方程為:Y = 15. 08X + 28. 88 r = 0. 999線性范圍8. 5 ～ 136 μg。
3. 4 精密度試驗(yàn)
取對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5 次，每次進(jìn)樣20 μL，測(cè)得焦谷氨酸色譜峰面積的分別為1098. 49，1101. 26，1089. 04，1106. 52， 1092. 27 mV。其RSD 為0. 64% ( n = 5) ，結(jié)果表明精密度良好。
3. 5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一供試品溶液，在上述色譜條件下，分別于0，1，2，4，8，12， 24 h 各取20 μL 進(jìn)樣測(cè)定，峰面積分別為1127. 71，1121. 52，1117. 47，1119. 42， 1112. 5， 1104. 71， 1109. 55 mV，測(cè)得焦谷氨酸色譜峰峰面積的RSD 為0. 70% ( n = 7) ，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。
3. 6 加樣回收率試驗(yàn)
取批號(hào)為091001 的樣品( 含量為7. 65%) 0. 01 g 各9 份，精密稱量后，按3個(gè)水平加入“3. 2. 1”項(xiàng)下136 μg ·mL －1溶液1，2，5mL 各3 份，定容于10 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容，按上述色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，計(jì)算回收率。低、中、高濃度回收率( n = 3 ) 分別為99. 8%，100. 1%，100. 0%; RSD 分別為0. 25%， 0. 18%，0. 03%。
3. 7 方法專屬性試驗(yàn)
取焦谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、谷氨酸、谷氨酰胺對(duì)照品各10. 0 mg，混合后用流動(dòng)相定容于100 mL 量瓶中。按上述色譜條件取樣20μL進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示谷氨酸、谷氨酰胺色譜峰的出峰時(shí)間均不同于焦谷氨酸出峰時(shí)間，對(duì)焦谷氨酸檢測(cè)無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖4。
3. 8 檢測(cè)限及定量限
將“3. 2. 1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液依次稀釋至不同濃度，按上述色譜條件分別取樣20 μL 進(jìn)樣測(cè)定。按信噪比分別為3 和10 時(shí)進(jìn)行檢測(cè)限及定量限測(cè)定。焦谷氨酸的檢測(cè)限及定量限分別約為0. 136 μg 和0. 425 μg。
3. 9 含量測(cè)定
吸取20 μL 供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按照峰面積外標(biāo)法，進(jìn)樣3 次，峰面積分別為1127. 71，1115. 25，1112. 14 mV。計(jì)算出第091001 批山羊角中焦谷氨酸的含量為7. 65%，RSD = 0. 74% ( n = 3)。結(jié)果見(jiàn)圖5。
4 討論
在山羊角提取物中發(fā)現(xiàn)的焦谷氨酸此前沒(méi)有相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，而本文所建立的液相色譜檢測(cè)方法具有專屬性強(qiáng)，檢測(cè)方便，出峰時(shí)間快等特點(diǎn)，是一種適宜檢測(cè)山羊角提取物中焦谷氨酸含量的方法。
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